�T．は　じ　め　に

　DNAチップは基盤上に固定したDNAに対して標識した発現遺伝子をハイブリダイズさせ，蛍光検出器でイメージを取得し，コンピュータ解析する技術である。DNAチップ解析により，ある組織や細胞での，ある状態における遺伝子の発現状態の記録写真（snap shot）がとれるようになった。どのような場所のどのような場面で記録を残すかによってみえる画像（遺伝子発現パターン）は異なってくる。優れた研究テーマをもってDNAチップに応用すれば，疾患関連遺伝子が同定されるであろう。
　ヒトゲノム配列の概要版が発表され，ヒト遺伝子の研究に拍車がかかっている。いよいよポストゲノム時代の開幕である。ヒトゲノム配列解析の意義は遺伝子レベルでの人体解剖学に例えることができるであろう。すでにゲノム配列からほぼすべての遺伝子が抽出され，配列上は新規ヒト遺伝子というものはほとんどなくなってしまった。この意味を人体解剖学の歴史で例えると，最後まで名前の付いていなかった動脈に無名動脈の名が付けられて新しい血管の発見に終止符が打たれたのと同類の話である。もちろん複雑な生命現象を説明するためにはゲノム配列解析および遺伝子同定は一里塚にすぎず，これからゲノム情報を取り入れた形での新たな生化学，生理学，病理学，疫学，遺伝学が本格的に始まるであろう。解剖学の知識なくしては医学研究がありえないように，ゲノムの知識なくしてこれからの医学研究はありえないことを意味している。
　ゲノム配列がほぼ解読された今もなお過半数の遺伝子は機能が判っていない。機能を指し示す名前すらなく，データベース上のID番号で呼ばれhypothetical protein（仮想タンパク質）をコードする，まさにバーチャルな世界である。これまでのように一つ一つの遺伝子機能を詳細に解明していく研究の重要性は今後も変わらないが，これだけ遺伝子のカタログを目の前に差し出されると，いったいどの遺伝子を踏み込んだ解析の対象とするか，その見極めがますます重要になってくる。遺伝子機能の絞り込みのための一つのグローバルな手段としてゲノムレベルで遺伝子ネットワークを俯瞰的に観察するという研究スタイルが生まれてきており，このような方法論を機能ゲノム学（Functional Genomics）と呼ぶ。機能ゲノム学的解析手法とともにゲノム情報を構成する遺伝子の配列，機能，相同性，発現，変異などをコンピュータ上で体系的に解析する情報科学，バイオインフォマティクスが重要になってくる。
　このような要請のもとに登場したのがDNAチップ技術であり，ポストゲノム研究において重要な戦略的テクノロジーとなっている↑1〜3)↑。とはいえ，生まれてから数年しかたっていない，まだ揺籃期の技術であることも事実であり，技術的な制約も少なくない。いずれは技術的な問題は解決されていき，現在よりも普及し，基礎医学研究はもとより，臨床研究や診断の分野にDNAチップの応用されていくことはまちがいない。

�U．DNAチップの原理

　DNAチップの測定原理はハイブリダイゼーションに基づく核酸検出を微少環境で行えるようにしたものである。すなわちガラス，シリコンなどの表面上に多数の異なったDNAが高密度に整列化（アレイ化）されて固定されている。それゆえDNAマイクロアレイとも呼ばれる。基盤上でサンプルとなる標識DNAをハイブリダイズさせて，おのおののスポットからのシグナルを自動蛍光検出器で画像を取り込み，コンピュータでデータ解析する。
　従来のノーザンブロットなどの検出法においてはプローブが標識されており，メンブレン上に固定化されたサンプルmRNAに対してハイブリダイゼーションされ，検出されるが，DNAチップにおいてはこの関係が逆転している。すなわちmRNA全体が標識され，これを捉えるプローブDNAが固定されている。遺伝子発現検出を例に取ると，cDNAを固定したマイクロアレイにmRNAから逆転写反応で蛍光ヌクレオチドを取り込ませた標識cDNAをハイブリダイズさせてイメージを検出する。これにより数千〜1万のハイブリダイゼーションを一度に観察することが可能となる。たった1つの条件で多数のハイブリダイゼーションを効率よく行えるかという懸念があるが，これはDNAプローブを選ぶことにより解決が図られることになる。
　DNAチップが出現する前も遺伝子発現を網羅的にみようという試みはいくつもあり，differential screening，differential display，SAGEなど多くの手法を生み出した。いずれの方法も，メンブレンや電気泳動を用いた実験手法であり，処理能力（through-put：スループット）の点でDNAチップにはかなわない。また解析結果がすべてデジタル信号であるDNAチップの方がコンピュータ解析に適していることは容易に理解されよう。すべての遺伝子の配列が既知のものとなって，他の方法に比べてDNAチップの有利性はますます明瞭になってきた。

�V．DNAチップ：2つのタイプ

　DNAチップはアレイ化するDNAの種類や作製法により，大きく2つのタイプに分かれる。オリゴDNAをガラス表面上で合成していくオリゴヌクレオチドアレイと，DNA（主にcDNA）を乗せていくcDNAアレイである。同じDNAチップと呼ばれても，オリゴヌクレオチドアレイとcDNAアレイとは使用法はかなり異なっている（表1)。
　オリゴヌクレオチドアレイの代表はAffymetrix社のGene Chipである。その特徴は半導体作製用の光リソグラフを用いた製造法にあり，半導体チップに因んでDNAチップの名の由来ともなっている。現時点で一番集積度の高いDNAチップ（1.28×1.28平方cmに40万区画）はこのタイプである。ただし基盤上で合成できるDNAの長さには限界があり，20〜30塩基程度といわれている。この長さのDNAはハイブリダイセーション上，物理的な制約がある。しかし，Gene Chipではそれをカバーするような使用法，プロトコールが巧妙に考案されている。
　一方，cDNAアレイはPCRで増幅したcDNA断片（１キロ塩基対位）を張り付けたものである。これはDNAチップができる前の技術である，高密度フィルター（high density filter, HDF）をミニチュア化させたものと考えられる。DNAチップで期待されているのは，小型化に伴うハンドリングのしやすさ，より大量の解析，検出感度の向上，サンプルの節約，データ取得，処理の自動化，簡便化などが挙げられる。マイクロ化には新しい技術開発が必要であったが，これを足場にまたさらに新しい技術を生むもとにもなっている。

�W．DNAチップの研究フロー

　DNAチップ研究の流れを必要な関連機器や解析ソフトに言及しながら，ここではcDNAを張り付けていくタイプのDNAチップについて説明したい。詳細な実験手順書はいくつかまとまった成書があるので，そちらを参照されたい↑4〜6)↑。準備すべきものとしてはcDNAクローンセット，PCR増幅器，スポッター，蛍光検出器，イメージ解析ソフトなどである。各コンポーネントを調達して全体的なシステムを組む必要がある（図1)。

１．DNAスポッター
　DNAマイクロアレイを作製するためにはDNAスポッター（アレイヤーとも呼ばれる）が必要である。DNAスポッターはピン先を動かしてDNA溶液を96穴ないし384穴のマルチタイターウエル（MTW）からガラス表面に運んで乗せるための装置である。異なるサンプルを運ぶごとにピン先の洗浄と乾燥のサイクルが入る。機械部分はコンピュータ制御下でマイクロメートル単位の精度で作動する高性能モーターが組み合わせてあり，ピンをXYZ軸上に動かす。
　スポットするピンの形状には色々な種類があり，鋭利なピン先で一回一回打つタイプ，カラス口のように液を溜めて連続して打つタイプ，ピンとリングを組み合わせて連続して打つタイプなどがある。いずれの方式もそれぞれの工夫が施されており，スポッティング技術は向上している。
　ピン先はとくに重要であり，通常ピンは4〜32本がけを使うので，それぞれが同じ形状，同じ大きさのスポットを出すよう，よいロットのピンを充分量に揃える必要がある。使うピン先の種類によって，最適のスポットを得るためのDNA溶液の性状（粘性，表面張力）も違ってくる。現状のピン打ちタイプでは，数千から1万程度のスポットを1枚のスライドガラスに打つことは容易であるが，より高密度なもの作るとなると新たなディバイスが必要になるだろう。このためにインクジェットプリンターに用いるピエゾ素子を応用して，DNAをプリンティングする機器も開発されている。

２．ガラススライド
　DNAを張り付ける基盤としては蛍光バックグラウンドが少ないガラススライドを用いる。そこでガラス表面にDNAを強固に結合させることが必要となり，ガラス表面をさまざまなコーティング処理を施す。ポリ-L-リジン，シラン化，あるいはポリカルボジイミドなどが用いられる。チップ専用にコートされたスライドガラスも売り出されている。張り付けるDNAの方もコートの様式によっては末端修飾して結合効率を向上させることも行われている。DNA溶液の組成や物理的性質（粘性，表面張力，乾燥までの時間）などにも結合は微妙に影響されるので，仔細な条件検討が必要となる。

３．cDNAの調整
　スポットするためのDNAはPCRで増幅させたcDNA断片を用いる。大量のPCRを行うために96穴チューブを用いて一度に行う。同一ベクターにクローン化されたDNA断片では共通のベクタープライマーを用いて増幅させることができる。各cDNA特異的プライマーでPCRを行うこともある。PCR断片の収量を最適化する必要がある。PCR産物はゲルで確認し，濃度を定量する。増幅したDNA断片は精製カラムあるいはエタノール沈澱で濃縮精製する。cDNAの濃度が高い方がシグナルが強く出るので1mg/mlを目標に調整する。たいていの場合，一度のPCR反応で十分量のDNAがとれないので，同じサンプルで何度かPCR行って合わせて濃縮精製することになる。

４．標識cDNAの調整
　cDNAチップを用いた遺伝子発現モニタリングの一つの利点は2種類のサンプルから調整したmRNAを異なる蛍光色素で標識して同一スポット上でハイブリダイゼーションさせること（二色蛍光法）が可能な点である。
　蛍光色素には蛍光波長の重なりがほとんどないCy-3，Cy-5が最もよく用いられる。おのおののスポット上の赤（Cy-5)，緑（Cy-3）の蛍光強度の比を算出することで発現レベルの相対的な違いを知ることができる。
　基本プロトコールはスタンフォード大ブラウン博士のラボのホームページにある（http：//cmgm.stanford.edu/pbrown/)。比較的大量のmRNA（1〜2μg）を出発材料として，ただ1回の逆転写反応で蛍光ヌクレオチドを取り込ませて標識cDNAを作製するのが標準である。サンプル量が少なくてtotal RNAしか用意できないときなどはantisenceRNA増幅反応を取り入れて標識cDNAを増やす方法もある。これとは別に逆転写時にビオチンやDNP（dinitrophenyl）を取り込ませて，抗体反応，酵素反応を仲介することでシグナルを増幅する系もある。シグナル増幅する場合はそれが均等に増幅されることが必要条件である。検出までに多段階の反応を経れば，それだけ実験上の誤差を生じやすくなるので，テストチップを用いてコントロール遺伝子に同レベルの標識が入っているか調べるなど細心の注意が必要である。

５．検出器
　スポット上の蛍光シグナルの検出には専用の検出器（チップリーダー）を用いる。読み取りの方式により，スキャン型およびCCDカメラ型がある。またスキャン型では非共焦点型と共焦点型があり，後者の方がバックグラウンドは低くおさえられる。現在，蛍光検出器は国内外の多くの企業が製品を上市しており，選択範囲が広がっている。検出感度，検出できる蛍光の種類，読み取り時間，使いやすさ，付属の画像解析ソフトなどが選定条件に挙げられよう。

６．データマイニング
　DNAチップ実験の再現性に関する疑問が多いようである。確かに，多くのデータポイントの信頼区間は広く，とくに蛍光シグナルの弱い方ではなおさらである。確実なデータを出すためには少なくとも，コントロールとサンプルの間でCy3，Cy5のラベルを交換して比較する必要があり，これを複数回繰り返すことが望ましい。蛍光のレベルにもよるが，2倍以下の発現差は再現が取れないことが多い。確定にはRT-PCRなどの方法で再検する必要がある。DNAチップはその意味では，まだまだ改善の余地があるテクノロジーである。
　DNAチップ解析から出てくるデータ量は膨大なものになるので，その管理および系統的解析には専用のソフトウエアが必要である。検出器で取り込まれた画像（数十メガバイト/1枚）からスポットの位置を同定して，2色の蛍光強度をそれぞれ測定する。はじめのcDNAの種類とスポット位置の対応関係をつけて管理するソフトが必要がある。得られたデータをみやすく数値，グラフ，色調でビジュアル化するためのソフトウエアも必要である。さらには，それぞれのスポットをクリックすれば蛍光強度とともに遺伝子情報がポップアップするようなリレーショナルデータベースを構築することが望ましい。単に発現が増加，減少する候補遺伝子を抽出するのであれば，scatter plotと呼ばれる方法で解析すればよい（図2)。しかし，DNAチップの遺伝子発現データはさらに包括的な解析に回すことができる。とくにクラスター解析はよく用いられ，樹形図を生成する階層的クラスタリングやニューラルネットワークの手法を用いた非階層的クラスタリングなどの方法がある（図3)。クラスタリングの手法を用いて遺伝子発現パターンの類似性を見出すことができる。似たような発現変動を示すことを遺伝子機能の類似性の指標の一つと考えて，未知の遺伝子機能の推定や遺伝子変動の生物学的意義付けに応用されている↑7,8)↑。

７．DNAチップへのアクセス
　DNAチップは応用範囲の広い解析手法であり，臨床の教室で使ってみたいという要望も多いであろう。その場合どのようにしてDNAチップにアクセスすればよいのだろうか。筆者はヘリックス研究所においてin houseでDNAチップ研究を立ち上げた経験から，DNAチップを自前で作製するためのインフラ整備には強力なコミットメントが必要であることを痛感した。資金的にも人材的にも（工学系の研究員や何人ものテクニシャンが雇える)，また周りのラボがすべてゲノム研究をしているという恵まれた研究環境においても，立ち上げから結果が出始めるまでには2年の期間がかかった。当時はスポッターから自前で作製したので，今ではもっと時間と手間が節約できるであろうが，それでもDNAチップは多段階の要素をクリアしなければいけないので，通常の臨床教室が単独にやって手に負えるものではないだろう。
　現在，種々の形でのDNAチップ受託解析が盛んになっている。DNAチップを自作しなくても，遺伝子を張り付けた既製DNAチップも市販されるている。チップ上に乗っている遺伝子が実験目的に合えば，後は検出器と解析ソフトを揃えれば実験は始められる。サンプルさえ渡せばDNAチップ解析結果が返ってくるサービスもある。しかし価格，品質に加えて，問題が起こったときのトラブルシューティングなどままならないことも多い。2，3回実験してうまくいかなかったのでDNAチップは使えない技術だと決めるのは早計である。
　実際のDNAチップ研究の現場では，予備実験やコントロールを含めて相当の枚数を使って条件検討を重ねることになることが多い。理想的には所内に一つのファシリティーとしてDNAチップを作製する部門を作ることができれば，これが一番望ましい形態であろう。それが難しいならば，DNAチップ専門のラボと共同研究を結んでDNAチップにアクセスするのが最も確実である。たとえば，研究指向の若い臨床医を短期間でもDNAチップを作っているラボに送り込んで，得意のテーマで研究協力することができれば，両者にとってメリットは大きい。DNAチップ研究は，多くの人が技術や知識を集めて研究を進めることに意義がある。面白いテーマを持っている研究グループとDNAチップ技術を持っているグループの共同研究の場をもっと積極的に模索していくべきであろう。

�X．DNAチップを用いた研究の今後

　発生・分化，代謝をはじめ記憶などの生命現象から種々の疾患の発症・維持などの病態変化に附随する遺伝子発現をDNAチップで網羅的にモニターする研究が増えてきている↑9)↑。これにより機能未知であった遺伝子にも手がかりがつかめることがある。もちろんDNAチップで判明するのは基本的には遺伝子発現の上下，そのパターンであり，その遺伝子が原因なのか結果なのかはより詳細な研究が必要である。しかしDNAチップによってでしか着目できない遺伝子に至ることは大きな魅力である。さらにデータを集めてクラスター解析することにより，機能ヒエラルキーが判り，新規のパスウェイが浮かび上がったりすることもある。
　DNAチップが出始めた頃は原著論文数よりも総説数の方が多いとの批判があったが，現在，Pub Medで検索するとDNAチップ関連の論文数がすでに千を越え，論文データとしての市民権を獲得したといってよい。最近の免疫学的な研究に応用した例では，Th1，Th2細胞の遺伝子発現の違いをみたもの↑10)↑，T細胞の活性化による遺伝子発現をみたもの↑11)↑などが挙げられよう。
　最近ではDNAチップを臨床的な研究，とくにがんの性格診断に応用したものが多くなってきている。先駆的なものに，Staudt等による巨大B細胞リンパ種（DBL）の報告がある↑12)↑。DBLの遺伝子発現をDNAチップで遺伝子発現パターンを解析することにより，2つの明確なカテゴリーに分かれ，それは疾患の予後，薬剤の反応性とほぼ一致していることが明らかとなった。DBLは単一の疾患ではなく，実は2つの異なる疾患であることが明らかにされた。このようにDNAチップは病理組織像では検出できない違いを同定する，いわゆるデジタル病理診断を可能にするかもしれない。リウマチをはじめとする自己免疫疾患も異質の疾患の集合であることが予想され，DNAチップ解析により，分子レベルでの病型分類が可能になることが期待される。
　DNAチップ研究から出てくる生データの量は膨大なものになる。この中から論文になるものを精選していくわけであるが，他のデータポイントもウェブ上で補完データとして提供されることも多い。これらの遺伝子発現データを集大成して公共データベースを作成して，自由に閲覧できるようにしようという動きもある。たとえば，自分が研究している遺伝子が，思いもしない観点から行われたDNAチップの発現データベースの中で活性化されていることが判る，ということも今後チップ研究が進むにつれてどんどん増えてくることが予想される。

文　　　　　献

1) Cheung VG, Morley M, Childs G：Making and reading microarrays. Nat Genet 21（Suppl）：15-19, 1999
2) Gerhold, D, Rushmore T, Caskey CT et al：DNA chips：promising toys have become powerful tools. TIBS 24：168-173, 1999
3) Lockhart DJ, Winzeler EA：Genomics, gene expression and DNA arrays. Nature 405：827-836, 2000
4) DNA microarrays：A practical approach（Shena M ed), Oxford University Press, Oxford, 1999
5) 村松正明，那波宏之監修：DNAマイクロアレイと最新PCR法（細胞工学別冊)，秀潤社，東京，2000
6) 辻本豪三，田中利男編：機能ゲノム研究プロトコール（実験医学別冊)，羊土社，東京，2000
7) Brazma A, Vilo J：Gene expression data analysis. FEBS Lett 480：17-24, 2000
8) Sherlock G：Analysis of large-scale gene expression data. Curr Opin Immunol 12：201-205, 2000
9) Young RA：Biomedical discovery with DNA arrays. Cell 102：9-15, 2000
10) Rogge L, Bianchi E, Biffi M et al：Transcript imaging of the development of human T helper cells using oligonucleotide arrays. Nat Genet 25：96-101, 2000
11) Feske S, Giltnane J, Dolmetsch R et al：Gene regulation mediated by calcium signals in T lymphocytes. Nat Immunol 4：316-324, 2001
12) Alizadeh AA, Elsen MB, Staudt LM et al：Distinct types of diffuse large B-cell lymphoma identified by gene expression profiling. Nature 403：503-511, 2000
　

著者紹介
　1982年　千葉大学医学部卒業
　1989年　東京大学臨床系大学院修了
　1982年　千葉大学付属病院　研修医
　1983年　茨城県立中央病院　研修医
　1984年　東京大学付属病院分院第4内科　大学院生　1987年　DNAX研究所　博士研究員
　1990年　東京大学医科学研究所　教務職員のち助手
　1996年　ヘリックス研究所　部長研究員
　2000年　ヒュービットジュノミクス�梶@研究所長（現職)
主要研究テーマ：ゲノム医学

表 1　オリゴヌクレオチップとcDNAチップの比較

合成型張り付け型

作製法 ガラス盤上でDNA合成 ガラス盤上にDNA固定
技術開発 Fodor等の方法による光リソグラフ Brown's Lab（スタンフォード大)
集積度 16,000〜400,000/チップ 10000/チップ
プローブ プローブの長さが限定（20塩基程度）予め塩基配列が必要。 プローブに限定はない。通常cDNAを用いる。塩基配列は必要ではない。
主な企業 Affymetrix Incyte, Molecular Dynamicsなど
応　　用 シークエンス（SBH)
多型性，変異の検出
遺伝子発現モニタリング 遺伝子発現モニタリング
(GEM＝gene expression monitoring)

図 1　DNAチップ解析のフローチャート

図 2　Scatter plotの例

図 3　クラスタリングの例